当前位置： 输尿管结石碎石价格 > 急性输尿管结石 > 草酸钙结石形成过程中Randall斑的全
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肾结石的患病率将近占成年人群的9%，且不断地向全世界范围增长。这种处境受到一定医学和经济上的影响，并且报道与一些并发症有关，如：代谢综合症和终末期肾病。肾结石形成的发病机理已经被研究了，有两大理论用于用于预测结石形成。一条途径涉及Bellini管内晶体的形成，就是所谓的Randall栓塞，通过体外实验高草酸尿症感应动物模型及人体基础高草酸尿症和磷酸钙、鸟粪石而被观察到，先天性草酸钙结石形成除外；另一条途径涉及间质内磷灰石斑块的过度生长，称为Randall斑，在一些先天性草酸钙结石形成过程中可以观察到。
在一个最近使用全基因组分析及基因重组老鼠的研究中，我们发现肾小管上皮细胞内骨桥蛋白（OPN）表达及晶体周围间质内巨噬细胞迁移成为结石形成的必要因素。我们也发现抗炎表型巨噬细胞通过肾脏晶体的吞噬作用在肾脏结石形成过程中发挥抑制作用。抗炎巨噬细胞的变异与感应被认为是肾脏结石疾病的一种潜在的治疗方式。然而，这个证据仅仅适用于与高草酸尿症老鼠模型有相似之处的Randall栓塞。Randall斑的理解对于阐明分子治疗的潜在可能性也十分必要，如：OPN及巨噬细胞相关基因。
关于一些先天性草酸钙肾结石的起因，Evan等对于Randall斑显微结构的研究做了较大贡献。尽管大量研究涉及动物高草酸尿症结石模型及人类样本，但是Randall斑在草酸钙结石晶体形成中的真实作用仍未可知。由于形态学、矿物质及矩阵调查提供Randall斑形成的病理学单元理论，所以细胞功能的分子水平分析对于更好理解Randall斑的角色是必要的。近几年发展的肾输尿管镜技术允许Randall斑更多地在显微结构和基因分析上的细节分析。
因此，为了建立肾结石分子靶向治疗体系，我们调查了人类乳突状组织Randall斑的基因表达分析和研究控制Randall斑变化的影响因素，通过使用微阵列及免疫组织化学分析的方式。
结果
病人背景
本研究中接受经皮肾镜或输尿管软镜手术的钙盐结石患者登记入组。在7例对照和23例草酸钙结石形成患者中，基础信息无显著不同，如：年龄、性别、患侧及基础代谢率。基于碎石术过程中获得的结石碎片的结石成分，草酸钙结石形成定义为肾或输尿管结石患者含有大于80%草酸钙晶体。两组中在血清及尿液参数无显著不同（图1）。
Randall斑和周围组织的监测
在肾内手术期间，通过肾输尿管镜，Randall斑以白色清晰钙盐区域被观察到，其通常被乳突状突起的上皮细胞覆盖。在相同的肾盏乳头内，一些Randall斑和管状栓塞共存。HE染色显示Randall斑周围乳突状上皮细胞的破坏和间质细胞的紊乱。Randall斑硝酸银染色（vonKossa染色）呈阳性，Pizzolato染色阴性，提示Randall斑含有磷酸钙成分，而不含有草酸钙（图1）。
能量分散X射线分析揭示钙和磷的光谱与Randall斑区域匹配，其他区域并没有显示他们的光谱（图2A）。透射电镜术（TEM）显示在Randall斑周围间质细胞空间内和肾小管细胞基底膜周围间质外有大量的胶原纤维（图2B）。免疫组织化学透射电镜术显示与不伴有Randall斑的肾小管细胞及间质细胞相比，Randall斑中OPN的大量弥散和高表达被认为是草酸钙和磷酸钙结石的代表模型。
草酸钙结石形成及对照组乳突状组织的基因分析
微阵列分析用于比较非结石病人（C组）和来自草酸钙结石形成组的非Randall斑（N组）及Randall斑（P组）组织中乳突状组织的基因表达分析。聚类分析反应草酸钙结石形成的基因表达分析（包括N组和P组）与非结石病人（C组）显著性不同（图3A）。散点图显示C组与N或P组的基因表达有显著地不同，而N组与P组仅有较小不同（图3B）。
图4A基因微阵列对照结果显示与C组对照组病人相比，草酸钙结石形成病人中P组与N组基因表达有两倍的增长或下降。与C组相比，P组和N组分别有和个基因多表达，并且它们中70%-97%（个基因）在P组和N组相互分享。相反，与C组相比，P组和N组分别有和个基因低表达，并且它们中的71%-91%（个基因）在P组和N组共有。此外，与N组相比，P组中的21个基因和10个基因分别显示高表达和低表达（图4）。
独创性途径分析揭示与C组相比，N组和P组有显著的激活途径：cAMP调节信号、凝血系统、GA信号转导、外源性凝血酶原激活途径和钙离子信号（表2）。
每种疾病和功能分析，P组和N组共同的上调基因都是根据细胞或神经元去极化、受精、离子或碳水化合物或单糖运输、导管细胞变异、雄烯二酮改变和内分泌细胞去极进行分类。而P组和N组共同的下调基因都是根据肥胖、细胞黏附、皮肤的弹性、白血病、内分泌腺发育不全、离子平衡、磷脂酰丝氨酸的分布、血糖控制水平和代谢性骨病进行分类的（表3）。
补充表1-3显示N组和P组中前个上调或下调基因及基因网络与C组的比较。
草酸钙结石形成中Randall斑组织的基因分析
表4列出了P组前8大基因上调大于2倍或下调小于0.5倍与N组的比较。
补充表4显示了P组与N组在上调大于2倍或下调小于0.5倍基因网络分析表达不同的比较。高得分网络反应LCN2、IL11、SLPI、mucin4、PTGS1、MMD和可读框4的上调及钾通道内向整流亚家族J成员1、SLC12A1和NALCN的下调与细胞外炎性细胞因子和细胞内信号通路息息相关（图5）。
与N组相比，IL1β和TNF在P组中被确定上调细胞因子（补充表5）。
毒性反应显示LCN2、IL11、GPX3和AQP1易致急性肾衰竭、肾缺血-再灌注损伤、心脏肥大和氧化应激（表5）。
草酸钙结石形成中Randall斑乳突状组织上调或下调分子的确认
为了确认mRNA和蛋白质表达结果，我们使用qPCR和免疫组织化学染色。P组中LCN2、IL11、SLPI、PTGS1、GPX3和MMD的mRNA表达显著高于N组，而SCGB1D2、SLC12A1、和NALCN的mRNA表达低于N组（图6，A和B）。
根据qPCR结果，我们通过免疫组织化学检测了不同调整基因的蛋白质表达。LCN2、IL11、GPX3和SCGB1D2的蛋白质表达普遍在泌尿道上皮细胞、肾小管上皮细胞和肾乳头的间隙处。PTGS1、MMD、SLC12A1和NALCN蛋白质主要表达在上皮细胞、管状细胞和肾乳突状组织的间质处。P组中LCN2、IL11、GPX3和MMD表达相对强烈，而SCB1D2、SLC12A1和NALCN表达弱于其他组（图7，A和B）。
Randall斑和正常乳突状组织间促炎症反应与细胞凋亡相关分子的确认
根据网络、上调因子和毒性分析，我们进一步比较了C组、N组和P组间促炎因子表达和细胞凋亡。N组和P组中IL1B、一氧化氮合酶2和TNF的表达显著高于C组。与其他组相比，P组细胞染色阳性的数量如：CD68、CD、中性粒细胞弹性蛋白酶和TUNEL分别代表巨噬细胞、浆细胞和中性粒细胞，显著增加（图8）。
讨论
一些研究已经报道了先天性草酸钙结石形成的Randall斑的基础和临床特点。关于Randall斑的最近报道往往倾向于使用要么计算机和显微技术，要么24小时尿液样本临床特点。通过微计算机断层扫描技术，Williams等报道了Randall斑中结石生长的概念，即草酸钙晶体开始粘附于Randall斑，通过乳突状上皮细胞的丢失，起源于乳突状间质磷灰石，并且然后从肾脏集合系统分泌。核磁共振（光谱）分析揭示Randall斑中的磷灰石是磷酸钙的组成部分，并且Randall斑包括不同比例的蛋白质、粘多糖、脂质和碳酸盐。另一研究通过使用X射线微分析和电子显微镜检查表明Randall斑既有高水平锌，并且与钙化胶原纤维有关及膜泡中也有晶体呈现。
Randall斑与草酸钙结石形成的因素之间的关联目前是有争议的。尿量、泌尿系钙盐及柠檬酸盐的排出和血清骨钙素的水平似乎与Randall斑有关。然而，相关研究表明，通过24小时尿液分析及CT成像预测，小管栓塞与肾结石形成更加有关，而不是Randall斑。虽然日本泌尿系代谢异常的比率较美国低，但是尿石症的患病率在两个国家都在10%左右。这一发现显示不仅代谢水平，而且分子水平研究对肾结石发病机理特点是必要的。由于形态学和分子学分析为了确定Randall斑的发病机理，都被要求去分析草酸钙结石形成Randall斑的关联，所以我们在这个研究中使用从肾结石患者取出的乳突状组织样品，进行基因组和免疫组织化学分析。
在这我们检测了足够大小的Randall斑，以致于内窥镜下可以直视看到。阳性结果的获得主要在大的Randall斑vonKossa染色，而不是Pizzolato染色，表明它们包含磷酸钙成分，而不是草酸钙成分。基底膜周围的间质处发现有大量的胶原纤维，有或无Randall斑。Randall斑显示弥漫的OPN表达。我们的结果与以前的一些报道是一致的，即Randall斑是由磷酸钙组成，并且它们的起源与胶原纤维及OPN表达是有关联的。逐渐增多的胶原纤维及OPN表达在Randall斑生长过程中发挥了决定性作用。它们也在其他分子的表达上有助于产生巨大的变化，例如：涉及炎症反应和免疫、氧化应激和钠/钾转运及通道。
与非结石形成的C组比较显示，草酸钙结石形成的N组及P组有许多共同的上调或下调基因。权威通路分析显示与对照组病人的正常乳突状组织相比，信号通路的激活包括：cAMP、凝固、Ga和钙通道存在于草酸钙结石形成的Randall斑和正常乳突状组织中。与对照组乳突状组织相比，根据疾病与功能分析，草酸钙结石形成的乳突状组织中细胞超极化、生殖发育、变异和分子运输在增加，但在营养水平，细胞间粘附及有机体的发展却在降低。此外，与心血管系统、免疫反应和炎症疾病相关的其他的网络上升为草酸钙结石形成与对照组间高度不同的网络。结果的差异性可以从包含大量肾小管和间质细胞及少量泌尿道上皮细胞和免疫细胞（图8B和补充图1）的样本组织中的多相性推断出。然而，上述的草酸钙结石形成与非结石形成间的预测联系支持Randall斑形成理论，涉及细胞结构的紊乱、信号转导、变异、矿物密度、组织炎症和血管形成。
微阵列、网络和有效性分析显示草酸钙结石形成组中Randall斑乳突状组织含有高LCN2、IL11、PTGS1、GPX3和MMD高表达，及低SLC12A1和NALCN表达。网络分析反应这些基因通过细胞外信号调节直接相互联系。LCN2，也被称为中性粒细胞白明胶酶相关LCN，表达在肾小管细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，与细胞凋亡及炎症相关。IL11，IL6家族中一个成员，与氧化应激和代偿性增殖相关。一些研究报道中性粒细胞白明胶酶相关LCN和IL11是AKI重要的生物标志物。
PTGS1也被成为环氧合酶1，在肾脏中起血管收缩剂作用，并且有助于高血压的发展。Stoller等已经支持性的猜测肾结石和Randall斑可能由肾脏血管损伤引起。GPX3在基底膜肾小管细胞被发现，证实了氧化应激的存在。毒性分析显示急性肾衰竭、缺血-再灌注损伤和氧化应激与LCN2、GPX3、IL11及AQP1的基因表达有关，例如不仅肾小管和泌尿道上皮细胞损伤，而且多种血管损伤导致Randall斑形成。虽然Akt/PI3K通路与肾细胞凋亡的抑制和血管化生长有关，但是MMD明确地调控Akt/PI3K在巨噬细胞中的激活。因为MMD表达通过促炎巨噬细胞的刺激发生，所以MMD上调导致促炎细胞因子和氧化应激的激活。
下调基因SLC12A1和NALCN分别编码成了膜泡运输和通道。SLC12A1是一个在Henle环的升肢上发现的钠-钾-氯化物输送者，并且对Batter综合症1负责。SLC12A1缺乏导致肾低钾血症、碱中毒、高钙尿症和肾钙质沉着症，并且我们以前发现草酸钙结石形成有SLC12A1单核苷酸多态性。NALCN是一个非选择性钠离子渗透通道，主要在神经细胞内与渗透调节有关。虽然NALCN对肾乳突状组织的贡献至今仍未发现，但是这个基因的缺乏可能导致肾细胞的破坏和肾小管矿物饱和与SLC12A1的改变。
最后，除了检测的炎症网络和每一个候选基因使用Randall斑地址的确认，上调分析显示IL1B和TNF的激活。因此，我们确认了主要的促炎瀑布反应和细胞表达。正如最近的一个研究提到，这些炎症和细胞紊乱可能又助于Randall斑的形成（图9）。
这个研究有一些不足。首先，临床数据的缺乏，像那些24小时尿液样本限制了病人基因表达分析的临床意义。第二，活检的乳突状组织的多相性和机械损伤可能导致分析中的不一致，伴随着免疫反应和免疫组织化学显示的免疫细胞的有限性渗透的迹象。第三，来自相同肾脏组织伴或不伴有Randall斑乳突状组织的比较降低了其他相关候选基因的检测，不具有统计学，但有临床意义。
总之，我们发现有力证据显示基因相关的肾脏损伤、血管收缩、氧化应激、巨噬细胞和钠/钾运输和转运通过促炎因子激活有助于草酸钙结石形成中Randall斑的发生，通过MAP激酶（促分裂素原活化蛋白激酶）和Akt/PI3K通路。据我们所知，这是第一篇关于Randall斑乳突状组织基因表达调控的报道，这可能有助于先天性草酸钙结石分子靶向治疗的发展。
临床方法
病人
这项研究通过了名古屋市大学伦理委员会（NO.）。所有参与者知情同意。在年11月至年4月间，在我们机构活检了23例经过PCNL和RIRS手术的先天性草酸钙结石患者的肾脏乳突状组织。结石患者和对照组的平均年龄是20-80岁。患者伴有急性尿路感染、代谢和自身免疫疾病、癌症和严重肾积水（3-4级）除外。
样本组织在每个患者的两个不同区域单独收集：伴有Randall斑的肾脏乳突状组织（P组）和不伴有Randall斑的正常乳突状组织（N组）。我们也从不伴有尿石病的7例因泌尿系肿瘤和出血或肾上腺肿瘤的粘附筛查而经历输尿管镜或肾切除术的患者中收集正常肾脏乳突状组织作为对照组（C组）。对于肾切除术，我们用手术刀切取乳突状粘膜组织。
手术步骤
对于经皮肾镜，为了碎石和使用F18微创PCNL通道及碎石机而冲走肾盂结石，我们从下盏穿刺进入集合系统。对于软镜，输尿管导管鞘（12/14F，cook）插入所有患者输尿管内。我们使用输尿管软镜和钬激光碎石系统进行碎石。清除碎石后，我们使用活检钳（cookorboston）从上盏获取肾脏乳突状组织样本。每组样本都保存在4%甲醛溶液（PFA）中，以供免疫组织化学分析和RNA保存，及微阵列和PCR分析。如果通过冲洗在活检区域仍有不能控制的出血，可以使用激光凝固。在PCNL或RIRS术之后的所有患者均插入一根输尿管导管。
Randall斑的显微分析
取自Randall斑组中4%甲醛溶液保存的肾脏组织的切片采用如前所述的HE染色、Pizzolato染色和vonKossa染色而进行检测。
能谱X线分析用于检测Randall斑无机物钙化的成分。石蜡包埋部分通过磷酸缓冲液进行脱蜡和冲洗。这一部分先后通过2.5%戊二醛和2%四氧化锇进行固定。然后用50%-%乙醇系列进行脱水。样本被包埋在环氧树脂内，表面涂有铂，然后使用扫描电子显微镜进行拍照。样本中Randall斑的元素光谱通过使用Horiba系统的能量光谱X线分析进行确定。
Randall斑的显微结构和周围组织通过使用TEM进行检测。4%甲醛溶液保存部分通过0.1mol/L磷酸缓冲液（20ml）和2.5%戊二醛进行灌洗固定，提取，磷酸缓冲液冲洗，并且四氧化锇固定2小时。这种组织使用乙醇系列（50-%）脱水，包埋在环氧树脂内，并且在60°环境内聚合48小时。超片（99nm）使用铀和铅双重染色，并且通过JEM-透射显微镜检测。对于TEM免疫组织化学染色，这些组织在4°相同封闭液环境下被培养一整夜，使用多克隆抗人类OPN和兔IgG。第二大抗体是山羊抗-兔IgG金胶体颗粒。样本使用2%乙酸铀酰染色5分钟，并且通过铅溶液进行改进1分钟。
微阵列分析
总的RNA使用试剂盒从RNA保存组织中提取。互补DNA使用AgilentSurePrintG3微阵列进行转录组分析。微阵列数据通过使用GeneSpring13.1程序进行分析。两组间在基因表达上有两倍以上不同被认为有显著性差异（P0.01）。所有的微阵列数据被存储在基因表达库中。
数据通过IPA的使用而被分析。功能性分析被用于识别数据组中最有显著性的生物学功能和/或疾病。right-tailedFisher检验被用于计算P值，去确定由于唯一的机会而被分配给数据组的每一种生物学功能和/或疾病。一个网络就是分子间分子关系图解的代表，这就被来自文学、教科书或储存在独创性知识库权威信息中至少一篇参考书支持。
qPCR
对于qPCR，我们使用微阵列分析中使用过的改进的互补DNA。为了评估微阵列分析基因表达结果，验证实验通过对每一个竞争mRNA序列使用TaqMan基因表达分析而被进行。使用的引物被列在补充表6。每一个基因的表达通过内部控制而被标准化。
图1.Randall斑内窥镜和显微镜下分布。正常粘膜和Randall斑粘膜肾脏乳突状组织代表性图片。内窥镜图片显示软镜手术期间肾上盏乳突状粘膜。正常乳突状组织显示不伴有出血及钙化的肉质光滑粘膜。一些Randall斑显示相同乳突状组织白色斑片状病灶和管状的栓塞。微观组织采用HE染色、硝酸银染色（用于磷酸钙晶体检测）和Pizzolato染色（用于草酸钙晶体检测）。*Randall斑的位置。
图2.通过能量散射X线微量分析和透射电镜术获得超微结构观察。（A）Randall斑的能量散射X线微量分析。上图是非Randall斑、钙染色和磷染色组织的微观结构。下图显示的是每个组织碳、氧、钠、锇、钙和磷的光谱。L1，损害1（非Randall斑区域）；L2，损害2（另非Randall斑区域）；RP，Randall斑区域。（B）通过透射电镜术在乳突状组织观察Randall斑胶原纤维和非Randall斑损害正常肾小管细胞的超微结构细节。N，核心；箭头，基底膜。比例尺，2微米。（C）通过透射电镜术OPN的免疫电镜分析。OPN阳性区域是Randall斑和肾小管细胞的黑点（箭头）。箭头，基底膜。比例尺，1微米。
图3.通过微阵列分析，草酸钙结石形成组的Randall斑和正常组织及对照组患者的正常组织之间肾乳突状组织基因表达的对比。（A）人类阵列芯片所有个基因表达的聚类分析。C组，对照组患者的正常乳突状组织；N组，草酸钙结石形成组正常乳突状组织；P组，草酸钙结石形成组Randall斑乳突状组织。（B）C组和N组（左）、C组和P组（中间）和N组和P组（右）间基因表达不同的散点图。
图4.微阵列分析反应每一组间基因表达不同的多相性。（A）每一组和基因表达改变的对比。每一个提取值代表各组间在2倍或0.5倍不同表达情况下，统计学上不同基因的数量。P，草酸钙结石形成中Randall斑乳突状组织组；N，草酸钙结石形成中正常乳突状组织组；C组，对照组患者的正常乳突状组织；（B）基因选择数量的韦恩图显示草酸钙结石形成患者的正常及Randall斑乳突状组织和对照组患者（左红图）正常乳突状组织间2倍不同的表达，基因数量显示草酸钙结石形成患者的正常及Randall斑乳突状组织和对照组患者（右蓝图）正常乳突状组织间0.5倍不同的表达。
Genome-WideGeneExpressionProfilingofRandall’s
PlaquesinCalciumOxalateStoneFormers
KazumiTaguchi,*?ShuzoHamamoto,*AtsushiOkada,*ReiUnno,*HideyukiKamisawa,*?
TakuNaiki,*RyosukeAndo,*KentaroMizuno,*NoriyasuKawai,*KeiichiTozawa,*
KenjiroKohri,*andTakahiroYasui*
*DepartmentofNephro-urology,NagoyaCityUniversityGraduateSchoolofMedicalSciences,Nagoya,Japan;and
?DepartmentofUrology,SocialMedicalCorporationKojunkaiDaidoHospital,DaidoClinic,Nagoya,Japan
JAmSocNephrol28:ccc–ccc,
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